MUDr. Martina Fialová

Téma:  Analýza  cirkulujících epiteliálních buněk u maligních a benigních  onemocnění štítné žlázy

Školitel: MUDr. Kubinyi Jozef, PhD., FEBNM

Konzultant: Prof. MUDr. Bobek Vladimír, PhD.

Anotace: Onemocnění  štítné žlázy (šž) patří po diabetu melitu k 2. nejčastější  endokrinopatii. Zahrnují širokou škálu patologických nálezů od prosté difusní strumy, přes autoimunitní thyreoiditidu, G-B  toxickou strumu až po uzlové strumy benigní  či maligní. Jejich diagnostika je plně v gesci endokrinologů, kteří  využívají  širokou  paletu vyšetřovacích metod : anamnézu, fyzikální vyšetření, laboratorní vyšetření ( TSH, fT3, fT4, TRAK, anti TPO, Tg), dnes již nezbytné ultrazvukové vyšetření krku, scintigrafii štítné žlázy (99mTc, Na 99mTc, NA 123I, Na133I), CT,PET a MRI /1/.

Ve středu našeho zájmu je zejména poslední jmenovaná skupina- uzlová struma zahrnující jak benigní uzly: adenom, cysty, involuční uzel, adenom parathyreoidey, zánětlivá ložiska: absces, granulom, ložisková thyreoiditida, ale hlavně maligní nádory: papilární , folikulární, medulární,  anaplastický karcinom, lymfom, sarkom, metastázy jiných nádorů.  Karcinomy štítné žlázy jsou nejčastější  endokrinní  tumory a tvoří 90% všech endokrinních neoplazií. Diferencované karcinomy štítné žlázy patří obvykle k pomalu rostoucím tumorům, ale mohou mít i agresivní biologickou povahu./1/. Incidence karcinomů štítné žlázy v ČR je 36-60 případů na 1 milion obyvatel a mezi zhoubnými nádory zaujímají 0,5 – 1%. Přesto patří u mladších lidí (ve věku do 45 let) mezi 5 nejčastějších karcinomů a počet těchto nádorů stále narůstá.  /4/

Diferenciální diagnostika uzlové strumy se mnohdy dnes již neobejde bez histologické verifikace pomocí procedury FNAB ( fine needle aspiration biopsy –aspirační biopsie tenkou jehlou), která, pokud je dobře odebraná a vyhodnocená zkušeným cytologem, vede k rozlišení benigních uzlů od maligních  a je  škálována systémem Bethesda  ( 6-ti stupňová standardizovaná mezinárodní klasifikace) a  významnou mírou spolurozhoduje o indikaci k operačnímu výkonu na štítné žláze  a jeho rozsahu /2/. Její zavedení v r. 2010 bylo velmi prospěšné a usnadnilo endokrinologům rozhodovací proces, nicméně má i svá slabá místa, nejproblematičtější se jeví kategorie zahrnující nálezy: Atypie nejistého významu/ Folikulární léze nejistého významu (Bethesda III). Jedná se o značně heterogenní skupinu, která je v rutinní praxi nadměrně využívána, ačkoliv neumožňuje jednoznačný klinický postup. Jsou diskutovány možnosti dalšího zpřesnění této i ostatních kategorií Bethesda klasifikace. Slibné se jeví zejména použití nových diagnostických, prognostických a prediktivních markerů, které nejsou v Bethesda systému zatím zahrnuty.

Cílem dizertační práce je detekovat přítomnost cirkulujících epiteliálních buněk (CEC-circulating epithelial cells) u  pacientů  s nodulem šž,  zaměřit se na skupinu klasifikovanou  jako Bethesda III a porovnat nálezy s benigními a maligními onemocněními šž . Součástí procesu detekce CEC  je i molekulární analýza  CTC ( circulating tumor cells) zaměřená na geny asociované s tumorem, s cílem zpřesnění prognozy onemocnění. Molekulární charakter CEC bude dále korelován s klinickým a histologickým nálezem. V případě detekce CEC s nádorovým charakterem, čili CTC, se předpokládá jejich využití  jako predikčního biomarkeru při indikaci chemoterapeutické a radioizotopové léčby.

Metodika: Pacienti: Do testované skupiny budou zařazeni pacienti s onemocněním šž klasifikovaným jako Bethesda III, dále pacienti s benigním nálezem po FNAB a pacienti s generalizovaným a lokálním nádorovým onemocněním šž.

 Izolace CEC/CTC: Odběr 2 vzorků periferní krve (  2x10 ml EDTA) ideálně před plánovaným chirurgickým výkonem a před plánovanou léčbou. Pro separaci buněk bude použita metoda založena na velikosti buněk (tzv. size-based exclusion test, MetaCell /3/). Krev je filtrována přes separační membránu, frakce buněk obohacena na základě velikosti je  3 dny kultivována ve standartním růstovém médiu (FBS-fetální bovinní sérum +ATB) při  T 37 °C, Dochází k eliminaci bílých krvinek, na membráně pozorujeme buňky epiteliálního původu velikosti nad 8 µm. Buňky jsou zobrazovány pomocí vitálního fluorescenčního barvení ( NucBlue,Celltracker). Barvené buňky jsou hodnoceny pod fluorescenčním mikroskopem na základě cytomorfologických charakteristik.

Výstupem hodnocení je popis digitálních snímků a v případě pozitivního nálezu jsou buňky lyzovány a uskladněny pro analýzu genové exprese a mutační analýzu.

Do souboru budou zahrnuti pacienti operovaní pro onemocnění šž na  3. chirurgické klinice  1.LF UK a FN Motol  a léčení na Klinice nukleární medicíny a endokrinologie 2. LF UK a FN Motol,  jejich histologické nálezy  budou vyšetřeny v Ústavu patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN Motol ,  vyšetření cirkulujících epiteliálních buňek  a genové exprese  bude  prováděno v Centru aplikované bioimplantologie FNKV.

Cíl práce:

 1. Zjistit, zda dokážeme tímto způsobem izolovat ze vzorků periferní krve viabilní cirkulující epiteliální buňky thyreoidálního původu a v jaké míře

2. Analyzovat tyto buňky a na základě jejich genových charakteristik stanovit jejich potenciální riziko  (malignity)pro nositele

3. Vytipovat panel genů typických (specifických) pro jednotlivé druhy karcinomů štítné žlázy a zodpovědných za jejich agresivní chování

4. Nalezení  těch nejcitlivějších diagnostických, prognostických a prediktivních markerů pomocí tekuté biopsie