MUDr. Martina Fialová
Téma: Analýza cirkulujících epiteliálních buněk u maligních a benigních onemocnění štítné žlázy
Školitel: MUDr. Kubinyi Jozef, PhD., FEBNM
Konzultant: Prof. MUDr. Bobek Vladimír, PhD.
Anotace: Onemocnění štítné žlázy (šž) patří po diabetu melitu k 2. nejčastější endokrinopatii. Zahrnují širokou škálu patologických nálezů od prosté difusní strumy, přes autoimunitní thyreoiditidu, G-B toxickou strumu až po uzlové strumy benigní či maligní. Jejich diagnostika je plně v gesci endokrinologů, kteří využívají širokou paletu vyšetřovacích metod : anamnézu, fyzikální vyšetření, laboratorní vyšetření ( TSH, fT3, fT4, TRAK, anti TPO, Tg), dnes již nezbytné ultrazvukové vyšetření krku, scintigrafii štítné žlázy (99mTc, Na 99mTc, NA 123I, Na133I), CT,PET a MRI /1/.
Ve středu našeho zájmu je zejména poslední jmenovaná skupina- uzlová struma zahrnující jak benigní uzly: adenom, cysty, involuční uzel, adenom parathyreoidey, zánětlivá ložiska: absces, granulom, ložisková thyreoiditida, ale hlavně maligní nádory: papilární , folikulární, medulární, anaplastický karcinom, lymfom, sarkom, metastázy jiných nádorů. Karcinomy štítné žlázy jsou nejčastější endokrinní tumory a tvoří 90% všech endokrinních neoplazií. Diferencované karcinomy štítné žlázy patří obvykle k pomalu rostoucím tumorům, ale mohou mít i agresivní biologickou povahu./1/. Incidence karcinomů štítné žlázy v ČR je 36-60 případů na 1 milion obyvatel a mezi zhoubnými nádory zaujímají 0,5 – 1%. Přesto patří u mladších lidí (ve věku do 45 let) mezi 5 nejčastějších karcinomů a počet těchto nádorů stále narůstá. /4/
Diferenciální diagnostika uzlové strumy se mnohdy dnes již neobejde bez histologické verifikace pomocí procedury FNAB ( fine needle aspiration biopsy –aspirační biopsie tenkou jehlou), která, pokud je dobře odebraná a vyhodnocená zkušeným cytologem, vede k rozlišení benigních uzlů od maligních a je škálována systémem Bethesda ( 6-ti stupňová standardizovaná mezinárodní klasifikace) a významnou mírou spolurozhoduje o indikaci k operačnímu výkonu na štítné žláze a jeho rozsahu /2/. Její zavedení v r. 2010 bylo velmi prospěšné a usnadnilo endokrinologům rozhodovací proces, nicméně má i svá slabá místa, nejproblematičtější se jeví kategorie zahrnující nálezy: Atypie nejistého významu/ Folikulární léze nejistého významu (Bethesda III). Jedná se o značně heterogenní skupinu, která je v rutinní praxi nadměrně využívána, ačkoliv neumožňuje jednoznačný klinický postup. Jsou diskutovány možnosti dalšího zpřesnění této i ostatních kategorií Bethesda klasifikace. Slibné se jeví zejména použití nových diagnostických, prognostických a prediktivních markerů, které nejsou v Bethesda systému zatím zahrnuty.
Cílem dizertační práce je detekovat přítomnost cirkulujících epiteliálních buněk (CEC-circulating epithelial cells) u pacientů s nodulem šž, zaměřit se na skupinu klasifikovanou jako Bethesda III a porovnat nálezy s benigními a maligními onemocněními šž . Součástí procesu detekce CEC je i molekulární analýza CTC ( circulating tumor cells) zaměřená na geny asociované s tumorem, s cílem zpřesnění prognozy onemocnění. Molekulární charakter CEC bude dále korelován s klinickým a histologickým nálezem. V případě detekce CEC s nádorovým charakterem, čili CTC, se předpokládá jejich využití jako predikčního biomarkeru při indikaci chemoterapeutické a radioizotopové léčby.
Metodika: Pacienti: Do testované skupiny budou zařazeni pacienti s onemocněním šž klasifikovaným jako Bethesda III, dále pacienti s benigním nálezem po FNAB a pacienti s generalizovaným a lokálním nádorovým onemocněním šž.
Izolace CEC/CTC: Odběr 2 vzorků periferní krve ( 2x10 ml EDTA) ideálně před plánovaným chirurgickým výkonem a před plánovanou léčbou. Pro separaci buněk bude použita metoda založena na velikosti buněk (tzv. size-based exclusion test, MetaCell /3/). Krev je filtrována přes separační membránu, frakce buněk obohacena na základě velikosti je 3 dny kultivována ve standartním růstovém médiu (FBS-fetální bovinní sérum +ATB) při T 37 °C, Dochází k eliminaci bílých krvinek, na membráně pozorujeme buňky epiteliálního původu velikosti nad 8 µm. Buňky jsou zobrazovány pomocí vitálního fluorescenčního barvení ( NucBlue,Celltracker). Barvené buňky jsou hodnoceny pod fluorescenčním mikroskopem na základě cytomorfologických charakteristik.
Výstupem hodnocení je popis digitálních snímků a v případě pozitivního nálezu jsou buňky lyzovány a uskladněny pro analýzu genové exprese a mutační analýzu.
Do souboru budou zahrnuti pacienti operovaní pro onemocnění šž na 3. chirurgické klinice 1.LF UK a FN Motol a léčení na Klinice nukleární medicíny a endokrinologie 2. LF UK a FN Motol, jejich histologické nálezy budou vyšetřeny v Ústavu patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN Motol , vyšetření cirkulujících epiteliálních buňek a genové exprese bude prováděno v Centru aplikované bioimplantologie FNKV.
Cíl práce:
1. Zjistit, zda dokážeme tímto způsobem izolovat ze vzorků periferní krve viabilní cirkulující epiteliální buňky thyreoidálního původu a v jaké míře
2. Analyzovat tyto buňky a na základě jejich genových charakteristik stanovit jejich potenciální riziko (malignity)pro nositele
3. Vytipovat panel genů typických (specifických) pro jednotlivé druhy karcinomů štítné žlázy a zodpovědných za jejich agresivní chování
4. Nalezení těch nejcitlivějších diagnostických, prognostických a prediktivních markerů pomocí tekuté biopsie